你相信“光”嘛!

光是電磁波，波長100nm-400nm稱為紫外光，400nm-780nm之間的光可被人眼觀察到，大于780nm稱為紅外光。人們只所以能夠看到色彩，是因?yàn)楣庹丈涞轿矬w上被物體反射回來。綠色植物之所以是綠色，是因?yàn)橹参镂�收了光中的紅色光譜。酶標(biāo)儀測(cè)定的原理是在特定波長下，檢測(cè)被測(cè)物的吸光值。

“光”與酶標(biāo)儀

酶標(biāo)儀，即酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，用來檢測(cè)ELISA反應(yīng)后的吸光度值，主要由光路系統(tǒng)與信號(hào)采集系統(tǒng)組成。工作原理為：

光源燈發(fā)出的光波經(jīng)過濾光片或單色器變成一束單色光，該單色光一部分被標(biāo)本吸收，另一部分則透過標(biāo)本照射到光電檢測(cè)器上;

光電檢測(cè)器將光信號(hào)轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的電信號(hào)，經(jīng)過一系列信號(hào)處理后送入微處理器進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和計(jì)算，最后顯示結(jié)果。

酶標(biāo)儀 分類

按濾光方式分類

分為濾光片式酶標(biāo)儀(固定波長酶標(biāo)儀)、光柵式酶標(biāo)儀(全波長酶標(biāo)儀)，這兩種都是屬于光吸收酶標(biāo)儀;

濾光片是光學(xué)玻璃片鍍制光學(xué)膜層，使濾光片對(duì)通過的波長發(fā)生變化，將不需要的波長光隔開。根據(jù)選配的濾光片，只能截取特定波長進(jìn)行檢測(cè)。

光柵型是使用物理性衍射光柵原理在不同角度將白光光源分開，再通過一系列狹縫將已選取的激發(fā)波長分出來。光柵型酶標(biāo)儀可以截取光源波長范圍內(nèi)的任意波長，靈活度更高。

目前濾光片系統(tǒng)因價(jià)格較為便宜，檢測(cè)靈敏度高，帶寬的可選擇性強(qiáng)，可以進(jìn)行快速的濾光片切換等優(yōu)點(diǎn)，其應(yīng)用更廣。

討論--光柵和濾光片的區(qū)別比較

a、光的純度區(qū)別比較

光電檢測(cè)以采用純度高的光為佳，但不管采用哪種分光器，都不可能得到絕對(duì)純的光。

光柵：就光柵分光后的一點(diǎn)而言，光是純的，但由于透光孔具有一定寬度，比色皿所接受的光，是一個(gè)在指定波長附近波段上的等強(qiáng)的光。

濾光片：經(jīng)濾光片分光后，通過透光孔被比色皿所接受的光也是一個(gè)波段，但在指定波長上光的強(qiáng)度最高，呈正態(tài)分布。

b、光的穩(wěn)定性區(qū)別比較

光柵：棱鏡或者光柵片的繞軸旋轉(zhuǎn)，由于不可避免的機(jī)械誤差，并且小角度的偏差經(jīng)過2-3次反射，會(huì)造成很大的偏差，造成波長的不穩(wěn)定。另外光柵是窄縫，其能量也會(huì)很弱，小的檢測(cè)電壓信號(hào)為了獲得大的電壓值，必須以大倍數(shù)放大，這樣誤差也會(huì)被放大，會(huì)造成檢測(cè)的不穩(wěn)定

濾光片：由于從同一濾光片上每一點(diǎn)透過的光的波長都是相同的，每個(gè)位置是通過光偶準(zhǔn)確定位，不受儀器本身機(jī)械誤差的影響，所以，光強(qiáng)經(jīng)會(huì)聚后，能量很高，電壓信號(hào)也會(huì)相對(duì)強(qiáng)，主流光很強(qiáng)，其它雜光的影響就會(huì)很弱很弱，可以忽略到不計(jì)，誤差也會(huì)很小，光是穩(wěn)定的，檢測(cè)相對(duì)很穩(wěn)定。

c、設(shè)備后期維護(hù)區(qū)別

光柵：一旦出現(xiàn)螺絲松動(dòng)，傳動(dòng)誤差，更換燈泡，造成中心波長偏移，那一般很難再調(diào)整回合適位置，必須由專業(yè)廠家來用專業(yè)設(shè)備調(diào)試完成，事實(shí)上國內(nèi)大多數(shù)用戶因?yàn)闆]有得到這方面的培訓(xùn)與告知，所以基本用了一年以后，發(fā)生了偏差也不會(huì)去找廠家去校準(zhǔn)了。

濾光片：結(jié)構(gòu)簡單，便于維護(hù)。只要稍加培訓(xùn)即可完成維護(hù)。

d、儀器檢測(cè)靈敏度區(qū)別

濾光片具有非常好的透光率 (可高于85%)，也就是說光能量的損失比較少。在一個(gè)熒光檢測(cè)中，經(jīng)過濾光片進(jìn)入樣本的激發(fā)光和從樣本透過濾光片進(jìn)入檢測(cè)器的發(fā)射光都只有少量的損失(大約10%)。光的損失較少，光的能量自然較大，熒光的信號(hào)自然很容易檢測(cè)。這是獲得高信噪比(SNR)的最初始保證。所以，由于有高的信噪比(SNR)保證，濾光片系統(tǒng)從酶標(biāo)儀誕生以來一直就是高靈敏度檢測(cè)的黃金標(biāo)準(zhǔn)。我們也不難發(fā)現(xiàn)很多有光柵型酶標(biāo)儀的廠家在一些檢測(cè)靈敏度要求比較高的高端應(yīng)用(如：TRF、TR-FRET、等)中，都會(huì)有另外配上濾光片模塊的設(shè)計(jì)。因?yàn)檫@些高端的應(yīng)用，光柵系統(tǒng)未能有滿意的效果或干脆做不到。

光柵系統(tǒng)帶來方便，但也有一些缺點(diǎn)。基于光路設(shè)計(jì)的問題，光柵的光能損失比濾片大很多。在熒光檢測(cè)中，光源經(jīng)過光柵而成的激發(fā)光已比原來的少了能量。樣本被激發(fā)后會(huì)放出發(fā)射光，發(fā)射光會(huì)透過光柵去分隔出需要的波長。被分隔后的發(fā)射光能量再損失。光柵酶標(biāo)儀的靈敏度沒有濾光片酶標(biāo)儀好的，所以在高端光柵型的酶標(biāo)儀也要配備濾光片模塊才能進(jìn)行TRF、TR-FRET等高靈敏度需求的檢測(cè)。

按功能分類

可分為單功能酶標(biāo)儀(分為光吸收、熒光、化學(xué)發(fā)光等)和多功能酶標(biāo)儀。多功能酶標(biāo)儀是以上兩種或更多檢測(cè)模塊的集成，通常情況下至少可提供光吸收、熒光這兩種最常見檢測(cè)功能，而一些中高端多功能酶標(biāo)儀還可支持化學(xué)發(fā)光、時(shí)間分辨熒光、熒光偏振、生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移，甚至還可以支持“Western Blot”和“上轉(zhuǎn)換發(fā)光”等檢測(cè)。

用什么“光”來檢測(cè)量

測(cè)量波長的原理

光通過被檢測(cè)物，前后的能量差異即是被檢測(cè)物吸收掉的能量，特定波長下，同一種被檢測(cè)物的濃度與被吸收的能量成定量關(guān)系。

檢測(cè)單位用OD值表示，OD是opticaldelnsity(光密度)的縮寫，表示被檢測(cè)物吸收掉的光密度，OD=10g(1/trans)，其中trans為檢測(cè)物的透光值。根據(jù)Bouger-amberT-beer法則，OD值與光強(qiáng)度成下述關(guān)系：

E=OD=logⅠ0/Ⅰ其中E表示被吸收的光密度，Ⅰ0為在檢測(cè)物之前的光強(qiáng)度，Ⅰ為從被檢測(cè)物出來的光強(qiáng)度。

OD值由下述公式計(jì)算：

E=OD=C×D×E

其中：C為檢測(cè)物的濃度;D為檢測(cè)物的厚度;E為摩爾因子。

在特定波長下測(cè)定每一種物質(zhì)都有其特定的波長，在此波長下，此物質(zhì)能夠吸收最多的光能量。如果選擇其它的波長段，就會(huì)造成檢測(cè)結(jié)果的不準(zhǔn)確。因此，在測(cè)定檢測(cè)物時(shí)，我們選擇特定的波長進(jìn)行檢測(cè)，稱為測(cè)量波長。

但是每一種物質(zhì)對(duì)光能量還存在一定的非特異性吸收，為了消除這種非特異性吸收，我們?cè)龠x取一個(gè)參照波長，以消除這個(gè)不準(zhǔn)確性。在參照波長下，檢測(cè)物光的吸收最小。檢測(cè)波長和參照波長的吸光值之差可以消除非特異性吸收。

常用波長

一般酶標(biāo)儀的測(cè)定波長在400～750nm或800nm之間，完全可以滿足ELISA的顯色測(cè)定。

目前國內(nèi)常見的ELISA試劑盒所使用的標(biāo)記用酶均為辣根過氧化物酶(HRP)，底物通常為四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和鄰苯二胺(OPD)，其在過氧化氫溶液的存在下，經(jīng)HRP作用，分別氧化為二氨基偶氮苯(DAB)和聯(lián)苯醌。

當(dāng)pH值為5.0左右時(shí)，DAB在450nm波長處有最大吸收;

當(dāng)pH值降為4.0時(shí)，最大吸收波長移至492 nm，同時(shí)摩爾消光系數(shù)變大，顯色加深，因而常用強(qiáng)酸如硫酸或鹽酸終止反應(yīng)。

TMB的氧化產(chǎn)物聯(lián)苯醌在波長450nm處有最大消光系數(shù)，如果HRP量少，H：O：和TMB過量時(shí)，則形成藍(lán)色的陽離子根。

降低pH，即可使藍(lán)色的陽離子根轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色的聯(lián)苯醌，使用硫酸作為終止劑可使產(chǎn)物穩(wěn)定90min。

450nm和492nm兩個(gè)波長是目前ELISA測(cè)定最常用的，考慮到雙波長比色的需要，還應(yīng)有630nm和405nm波長的濾光片。

單波長/多波長檢測(cè)

酶標(biāo)儀有單波長和雙波長檢測(cè)功能有時(shí)使用者不知在什么情況下使用單或雙波長檢測(cè)。

所謂的“單波長”就是使用一種對(duì)顯色具最大吸收的波長即450nm或492nm進(jìn)行比色測(cè)定;

而“雙波長”則除了用對(duì)顯色具最大吸收的波長即450nm或492nm進(jìn)行比色測(cè)定外，同時(shí)用對(duì)特異顯色不敏感的波長如630nm進(jìn)行測(cè)定，酶標(biāo)儀最后打印出來的吸光度則為二者之差。

630nm波長下得到的吸光度是非特異的，來自于板孔上諸如指紋、灰塵、臟物等所致的吸收。因此，在ELISA比色測(cè)定中，最好使用雙波長，且不必設(shè)空白孔。

吸光度測(cè)定范圍

通常，酶標(biāo)儀的吸光度測(cè)定范圍在0～2.5之間即可以滿足ELISA的測(cè)定要求。早期的酶標(biāo)儀可測(cè)定的吸光度一般在0～2.5之間，但現(xiàn)在基本上都做了拓寬，可達(dá)到3.5以上，并且能保持很好的精密度與線性。因此，對(duì)于酶標(biāo)儀的吸光度范圍不必去刻意追求大的吸光度范圍，主要看在一定的吸光度范圍內(nèi)的線性和精密度如何

檢測(cè)速度

酶標(biāo)儀的檢測(cè)速度是指其完成比色測(cè)定所需要的時(shí)間。所謂天下武功唯快不破，檢測(cè)速度快，有利于提高檢測(cè)的精密度，即避免由于測(cè)定過程中，因測(cè)定時(shí)間不同所致的各微孔間吸光度間的差異。目前市場(chǎng)上常見的酶標(biāo)儀檢測(cè)速度都非常快，通常在數(shù)秒鐘內(nèi)。

振板功能

酶標(biāo)儀的震板功能是指酶標(biāo)儀在對(duì)ELISA板孔進(jìn)行比色測(cè)定前對(duì)其進(jìn)行振蕩混勻，使板孔內(nèi)顏色均一。目前市場(chǎng)上常見的酶標(biāo)儀均有震板功能，有所不同的是震板方式，有的可按上下、左右或旋轉(zhuǎn)等方式及振蕩幅度等任意調(diào)節(jié)。使用有震板功能的酶標(biāo)儀，在進(jìn)行ELISA測(cè)定，顯色反應(yīng)完成加入終止液后，可不必振蕩混勻，直接放入酶標(biāo)儀測(cè)定即可。

溫育功能

溫育功能是指酶標(biāo)儀本身能按要求自動(dòng)精確地控制儀器內(nèi)部的溫度，使得ELISA測(cè)定中微孔板條的溫育過程可在儀器內(nèi)部完成，而無需再外配溫箱。

溫育功能只是酶標(biāo)儀的一個(gè)附加功能，是否具有并不能說明酶標(biāo)儀檔次的高低及儀器的優(yōu)劣。作為實(shí)驗(yàn)室是否選擇，則可根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)室的條件及需要來決定。

軟件功能

軟件功能是指酶標(biāo)儀所具有的對(duì)ELISA定性和定量測(cè)定及其他測(cè)定方式如酶標(biāo)動(dòng)力學(xué)、紫外和凝集等數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析并報(bào)告結(jié)果的功能。軟件功能是中高檔酶標(biāo)儀的一個(gè)非常重要的功能。

軟件在讀數(shù)前可設(shè)置讀數(shù)孔、波長、計(jì)算公式等內(nèi)容，在讀數(shù)后顯示相關(guān)數(shù)據(jù)。對(duì)于用戶來說，好的軟件功能，對(duì)實(shí)際工作會(huì)有較大的幫助。ELISA定性測(cè)定，酶標(biāo)儀如具有陽性判斷值(cut-off)及其測(cè)定“灰區(qū)”(即指測(cè)定吸光度處于cut—off周圍的一定區(qū)域，此區(qū)域內(nèi)結(jié)果應(yīng)為“可疑”)的統(tǒng)計(jì)計(jì)算功能，不但方便了實(shí)驗(yàn)室工作人員，而且在某些特定的情況下，有很高的實(shí)用價(jià)值。

檢測(cè)項(xiàng)目

▶臨床檢驗(yàn)項(xiàng)目

★感染免疫室檢測(cè)：乙肝五項(xiàng)(HBV)、甲肝抗體(HAV)、戊肝抗體(HEV)、丙肝抗體(HCV)、免疫球蛋白(IgG)、艾滋病抗體(HIV)、梅毒螺旋體抗體......

★血液免疫學(xué)檢測(cè)：免疫球蛋白A/G/M/E/D、免疫球蛋白輕鏈κ/λ、補(bǔ)體C3/C4、CRP、類風(fēng)濕因子、前白蛋白、銅藍(lán)蛋白、觸珠蛋白、β2微球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、酸性糖蛋白、超敏CRP、血清淀粉樣物質(zhì)A、γ痕跡蛋白、循環(huán)免疫復(fù)合物、ANA、ENA......

★過敏原檢測(cè)：血清總IgE、特異性IgE及過篩試驗(yàn)、ECP檢查......

★腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)：癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)、前列腺特異性抗原(PSA)、糖類抗原(CA199)、糖類抗原(CA125)、 糖類抗原(CA153)、鱗狀細(xì)胞癌抗原(SCC)......

★生殖醫(yī)學(xué)檢測(cè)：弓形蟲、風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒I型和II型、抗精子抗體、抗子宮內(nèi)膜抗體、抗卵巢抗體、抗滋養(yǎng)膜細(xì)胞抗體、抗hCG抗體......

▶食品安全檢測(cè)項(xiàng)目

★過敏原：食品 ;

★三聚氰胺：農(nóng)產(chǎn)品和食品 ;

★二噁英：農(nóng)產(chǎn)品和食品、環(huán)境樣品 ;

★獸藥殘留

★抗生素：農(nóng)產(chǎn)品和食品 ;

★克倫特羅/瘦肉精：禽畜的尿、毛、肉、奶、飼料等 ;

★農(nóng)藥殘留：農(nóng)產(chǎn)品、食品、水、土壤等

★殺蟲劑、殺菌劑、除草劑、植物/昆蟲生長調(diào)節(jié)劑 ;

★生物毒素：食品和飼料

★黃曲霉素;貝類毒素;嘔吐毒素;黃曲霉毒素B1;玉米赤霉烯酮;赭曲霉毒素A。

▶出入境檢驗(yàn)檢疫項(xiàng)目

★衛(wèi)生檢疫：出入境人員丙肝、HIV、梅毒抗體檢測(cè) ;

★動(dòng)物CIQ：豬傳染性胃腸炎病毒(生物素標(biāo)記414 nm)，豬呼吸道冠狀病毒(生物素標(biāo)記414 nm)，豬流行性腹瀉，雞傳染性法氏囊病(490 nm)，雞傳染性喉氣管炎，牛傳染性鼻氣管炎(450 nm)等出入境動(dòng)物病毒檢測(cè);

★植物CIQ：番茄黑環(huán)病毒檢測(cè)、豇豆重花葉病毒(堿性磷酸酶標(biāo)記405 nm)。

▶細(xì)胞增殖與細(xì)胞毒性檢測(cè)

★MTT 法 ：

通過測(cè)定570nm 波長處的吸光值，可間接反映活細(xì)胞的數(shù)量。細(xì)胞增殖越多越快，則吸光值越高;細(xì)胞毒性越大，則吸光值越低。

★CCK-8：

測(cè)定450nm吸光度：建議采用雙波長進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)波長450-490nm，參比波長600-650nm。

▶蛋白濃度測(cè)定(比色法)

★BCA法：562 nm;

★考馬斯亮藍(lán)法：595 nm;

★660nm蛋白分析定量試劑：660nm。

▶內(nèi)毒素檢測(cè)

★動(dòng)態(tài)顯色法(微量技術(shù))：405nm。

▶酶活測(cè)定

原理：酶活性的檢測(cè)基于底物NADH的消耗或產(chǎn)生，可以通過檢測(cè)NADH而間接定量酶活性。

檢測(cè)方法：37℃保溫下，在340nm處使用動(dòng)力學(xué)檢測(cè)方法測(cè)定酶活性。

★具體應(yīng)用：谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的檢測(cè)(肝功能) 、尿素氮的檢測(cè)(脲酶-NADH法)(腎功能)、葡萄糖6磷酸脫氫酶的檢測(cè)(溶血病)、已糖激酶(血清葡萄糖)。